茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶CcOMT2及其应用.pdf
(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(43)申请公布日(21)申请号2.4(22)申请日2022.11.11(71)申请人中国药科大学地址江苏省南京市鼓楼区童家巷24号(72)发明人(74)专利代理机构南京经纬专利商标代理有限公司32200专利代理师(51)Int.Cl.C12N9/10(2006.01)/70(2006.01)/54(2006.01)C12N1/21(2006.01)/06(2006.01)C12R1/19(2006.01)(54)发明名称茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶及其应用(57)摘要本发明公开了茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶及其应用，全长747bp，编码248个氨基酸。以3′‑OH‑去甲川陈皮素为底物进行体外酶活反应，具有较高的咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶活性，偏碱性条件可有效提高其酶活，且在部分二价阳离子存在时活性显著提高。可以作为工程菌的目的基因，用于体外催化3′‑OH‑去甲川陈皮素转化为川陈皮素，具有较高的应用价值。
权利要求书1页说明书5页序列表（电子公布）附图2页.一种咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶，其特征在于：所述蛋白质为如下任一种：(A1)氨基酸序列如.2所示；(A2)将.2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与(A1)所示的蛋白质具有95％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；(A3)在(A1)或(A2)的N端和/或C端连接表亲得到的具有相同功能的蛋白质。2.根据权利要求1所述咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶，其特征在于，所述来源于茶枝柑。3.一种生物材料，其特征在于：所述生物材料为下述(B1)至(B4)中的任一种：(B1)编码权利要求1或2所述的咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶的DNA分子；(B2)含有(B1)所述DNA分子的表达盒；(B3)含有(B1)所述DNA分子的重组载体、或含有(B2)所述表达盒的重组载体；(B4)含有(B1)所述DNA分子的重组微生物、或含有(B2)所述表达盒的重组微生物、或含有(B3)所述重组载体的重组微生物。4.根据权利要求3所述的生物材料，所述(B1)所述DNA分子选自如下(C1)或(C2)：(C1)核苷酸序列如.1所示；(C2)与：1所示的核苷酸序列具有至少95％或以上同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。
5.权利要求1‑2任一所述咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶，或者权利要求3‑4任一所述的生物材料，在3′‑OH‑去甲川陈皮素转化为川陈皮素中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述为催化3′‑OH‑去甲川陈皮素转化为川陈皮素的关键酶基因，该催化反应的最适温度为42，最适pH为Tris‑，当加入茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶及其应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶，还涉及茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶将3′‑OH‑去甲川陈皮素催化生成川陈皮素的应用。背景技术[0002]茶枝柑(“”)为芸香科柑橘属植物，成熟果皮可入药，主产于广东新会，又称新会柑、大红柑，果实可食用，果皮可做陈皮，又称广陈皮(，CRP)。[0003]川陈皮素是茶枝柑中质量控制的指标成分之一，也是茶枝柑的主要生物活性成分，川陈皮素作为一种多甲氧基黄酮类化合物，与非多甲氧基黄酮类化合物相比，具有较好的生物膜渗透性，生物利用度较高，它具有抗氧化、抗炎、抗癌抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等活性。
目前主要从药材中提取或者化学合成川陈皮素，存在工艺复杂、产生副产物及污染环境等问题。[0004]茶枝柑中富含类黄酮氧甲基转移酶(‑,FOMT)，通过S‑腺苷‑L‑甲硫氨酸(S‑‑l‑,SAM)提供甲基供体，取代类黄酮苯环上的羟基，形成氧甲基化类黄酮。根据OMT蛋白的分子量和阳离子依赖性，可将植物OMT分为咖啡酸OMT(COMT)和咖啡酰‑()两类。目前，关于柑橘类黄酮的生物合成已报道的FOMT有COMT亚家族的和，以及亚家族的，但均不具有催化3′‑OH‑去甲川陈皮素生成川陈皮素的功能发明内容[0005]有鉴于此，本发明采用分子生物学技术，克隆川陈皮素合成相关咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因，分析了该基因的核苷酸序列和翻译的氨基酸序列。采用大肠杆菌原核表达系统进行川陈皮素合成相关酶咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶的功能验证。通过蛋白纯化得到相关的氧甲基转移酶可直接体外催化合成川陈皮素。即本发明的目的之一在于提供一种茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶；本发明的目的之二在于提供茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因；本发明的目的之三在于提供所述茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶在制备3′‑OH‑去甲川陈皮素转化为川陈皮素的催化剂中的应用；本发明的目的之四在于提供所述茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因在原核生物中重建川陈皮素合成途径中的应用；本发明的目的之五在于提供制备重组咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶的方法；本发明的目的之六在于提供由所述方法制得的重组茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶；本发明的目的之七在于提供所述重组茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶在制备3′‑OH‑去甲川陈皮素转化为川陈皮素的催化剂中的应用；本发明的目的之八在于提供所述重组茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶在催化3′‑OH‑去甲川陈皮素转化为川陈皮素的最适反应条件。
[0006]为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：[0007]第一方面，本发明首先保护一种咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶，所述蛋白质为如下任一种：[0008](A1)氨基酸序列如.2所示；[0009](A2)将.2所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与(A1)所示的蛋白质具有95％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；[0010](A3)在(A1)或(A2)的N端和/或C端连接表亲得到的具有相同功能的蛋白质。[0011]本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的 分离得到的蛋白质的核苷酸序列具有95％或95％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质且 具有蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。 [0012] 在一些具体的实施方案中，所述来源于茶枝柑。 [0013] 第二方面，本发明还保护一种生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一 [0014](B1)编码权利要求1或2所述的咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶的DNA分子； [0015] (B2)含有(B1)所述DNA分子的表达盒； [0016] (B3)含有(B1)所述DNA分子的重组载体、或含有(B2)所述表达盒的重组载体； [0017] (B4)含有(B1)所述DNA分子的重组微生物、或含有(B2)所述表达盒的重组微生物、 或含有(B3)所述重组载体的重组微生物。
[0018] 在一些具体的实施方案中，(B1)所述DNA分子选自如下(C1)或(C2)： [0019] (C1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示； [0020] (C2)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少95％或以上同源性且编码具有相 同功能蛋白质的DNA分子。 [0021] 本发明所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体、病毒载 体等，具体如载体。 [0022] 第三方面，本发明还保护前文所述的茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶，前 文所述的生物材料，在3′‑OH‑去甲川陈皮素转化为川陈皮素中的应用。 [0023] 具体的，本发明保护前文的所述茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶在作为 3′‑OH‑去甲川陈皮素转化为川陈皮素的催化剂中的应用。 [0024] 更具体的，所述茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因为催化3′‑OH‑去甲 川陈皮素转化为川陈皮素的关键基因。 [0025] 更更具体的，该催化反应的最适温度为42，最适pH为Tris‑HCl pH9，当加入Mg 等二价阳离子时该反应的活性显著提高。[0026] 本发明提供了一种制备重组咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶的方法，所述将如 SEQ ID NO.1所示的茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因连入质粒 BamHI 和XhoI酶切位点，获得重组表达载体‑，再将获得的重组表达载体转化表达菌 株BL21(DE3)，在16、IPTG终浓度为0.5mM条件下诱导表达，提取纯化，获得重组茶枝柑咖 啡酰辅酶A氧甲基转移酶。
[0027] 所述提取的方法是收集菌体，在功率为30％条件下超声破碎，超声总时间13min， 每超声10s，暂停10s；然后在4、4000g条件下离心45min，收集上清。[0028] 所述纯化是使用镍柱纯化，用含咪唑浓度为250mM的洗脱液进行洗脱。 [0029] 由所述方法制得的重组茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶。制得的重组酶 当底物为3′‑OH‑去甲川陈皮素时，其表达产物的酶促反应最适温度为42，最适pH为碱性 (Tris‑HCl pH＝9)，当加入Mg 等二价阳离子时该反应的活性显著提高。[0030] 本发明的有益效果在于：本发明公开了茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶 及其基因，将茶枝柑咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因进行原核表达及酶活性的测定， 测得其具有较高的咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶活性，其DNA碱基序列和氨基酸序列均与已报 道的咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶基因序列有差异。因此，我们认为这是新的咖啡酰辅酶A氧 甲基转移酶基因，在Mg 等二价阳离子存在时其原核表达的酶活性高，作为工程菌的目的基因，制备重组蛋白作为催化剂体外合成川陈皮素，作为抗炎、抗癌以及防治心脑 血管等方面的药物，具有很好的应用前景。
附图说明 [0031] 图1：重组蛋白SDS‑PAGE电泳图；其中：泳道1：蛋白分子质量标准；泳道2：诱 导前菌体；泳道3：诱导后未纯化上清；泳道4：纯化的‑重组蛋白。 [0032] 图2：与3′‑OH‑去甲川陈皮素反应产物鉴定的HPLC(A)及质谱(B)分析图。 [0033] 图3：不同温度(A)、pH(B)和二价阳离子(C)对重组蛋白活性的影响。 具体实施方式 [0034] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以 更好地理解本发明并能给予实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。 [0035] 本发明中使用3′‑OH‑去甲川陈皮素和川陈皮素作为标品对照，检验咖啡酰辅酶A 氧甲基转移酶基因所表达的酶活性。